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松材线虫检疫技术操作办法

来源:中国森防信息网 时间:2017-04-12 10:23 [ 打印 ] [ 关闭 ]

1  主题内容及应检范围

1.1  本办法规定了松材线虫Bursaphelenchus xylophilus (Steiner et Buhrer) Nickle的检疫检验及检疫处理操作办法。

1.2  本办法适用于林业植物检疫机构对松科植物中松属Pinus spp.、冷杉属Abies spp.、云杉属Picea spp.、雪松属Cedru spp.、落叶松属Larix spp.植物的树木、枝条、伐桩、木材(含原木、锯材、切片)及其制品(含包装材料、电缆盘等)的检疫检验和检疫处理。

2  产地检疫

2.1  踏查

2.1.1  在由松科植物构成的,或以松树为主的生态林、用材林,特别是有松树栽植的风景名胜地,疫情发生区及毗邻地区,曾调入染疫木材(含原木、锯材、切片)及其制品的城镇、工矿企业、交通干线附近、无线通讯台站、广播电视信号台站、电力线路、仓库、码头、车站、驻军营房、贮木场及加工场(点)、集贸市场,以自然界线、道路为单位进行线路(目测)调查。

2.1.2  调查松树的针叶是否有黄绿色、黄褐色、红褐色萎蔫,是否整株枯死或未全部变红仍有部分呈绿色;枯死树针叶在小枝上当年不脱落(如黑松、马尾松等)或脱落(如思茅松);树脂分泌急剧减少,甚至停止;材质干枯,有蓝变现象。

2.1.3  调查松树是否有天牛危害的羽化孔、侵入孔、蛀道等痕迹。

2.1.4  需进一步确定疫情的,应取样进行分离鉴定。

2.1.4.1  在树干的下部(胸高处)、中部和上部(主侧枝交界处),用斧子、柴刀、木锯或木钻(钻头直径1 ~ 1.5 cm)在木质部采集样品。

2.1.4.2  取样时在取样部位剥净树皮和外围木质部,直接砍取100 ~ 200 g木片;或剥净树皮和外围木质部,用手摇钻从木质部至髓心钻取100 ~ 200 g木屑;或在取样部位分别截取2 cm厚的圆盘。样品标签须填写清楚(包括样品号、采集地点、树种、树龄、取样时间、采集人),与样品一起放入塑料袋内,用橡皮筋扎紧,带回室内检验。

2.2  贮木场及加工场(点)、集贸市场调查

2.2.1  木材(含原木、锯材、切片)及其制品采取楞垛表面或分层方式设点抽样调查。

2.2.2  调查数量每批次按总量(m3、垛)的5% ~ 10%抽取,疫情严重的应全部进行抽样调查。

2.3  疫情监测

2.3.1  定期普查

2.3.1.1  对辖区内由松科植物构成的,或以松树为主的生态林、用材林以及松木贮木场及加工场(点),或人为活动频繁的公路两旁松林,应进行定期普查。

2.3.1.2  每年3 ~ 5月和8 ~ 10月,应对上述地区的松林进行全面普查。

2.3.2  人工监测

2.3.2.1  在疫情发生区及毗邻地区,在当年秋季刚刚枯死的病树树干下部(胸高处)、中部和上部(主侧枝交界处),剥净树皮,选取靠近蛀道、蛹室部位,用手摇钻钻至树心,取松木木屑(100 ~ 200 g)进行分离鉴定。

2.3.2.2  对已确定发现松材线虫的林分,应对周围松林进行全面调查,以确定疫情发生范围。

2.3.3  打孔流胶法监测

2.3.3.1  对于松材线虫发生区或其边缘的松树,若外观正常,针叶无明显变色可以用打孔流胶法做初步诊断,要确定是否感染了松材线虫还需进行取样分离诊断法进行确认。

2.3.3.2  使用锤子和打孔器或铳子(直径10 ~ 15 mm)在松树主干上打一可见木质部的圆孔,位置和方向不限。

2.3.3.3  在春、夏、秋季,打孔后24 h即可进行观察;在冬季,打孔后48 ~ 72 h进行观察。

2.3.3.4  观察打孔后松树流脂情况,按下述标准确定流胶级别。

一级流胶:树脂从孔口流下,渗出量很多;

二级流胶:树脂从孔口流下,渗出量较多;

三级流胶:树脂沉积在孔口下缘;

四级流胶:树脂渗出到圆孔壁上,呈粒状;

五级流胶:孔壁上无树脂流出。

2.3.3.5  对于三至五级流胶的松树,按2.1.4进行取样分离鉴定。

2.3.4  天牛引诱剂监测

2.3.4.1  于松褐天牛羽化期,在通风良好便于观测的山顶或林道旁设置诱捕器。诱捕器距地面高度不得低于1.5 m,诱捕器间距50 ~ 100 m。

2.3.4.2  羽化高峰期1d检查1次,其余时间每隔3 ~ 5 d检查1次。将诱捕到的松褐天牛活体进行分离鉴定。

3  调运检疫

3.1  抽样比例

3.1.1  木材(含原木、锯材)及其制品按货物总量的1% ~ 20%抽样,样本数低于10个全检。

3.1.2  树木、枝条、伐桩按货物总量的1% ~ 5%抽样,样本数低于50个全检。

3.2  抽样方法

3.2.1  木材(含原木、锯材)及其制品、枝条、伐桩,采取表层或分层方式设点抽样检查。

3.2.2  抽取有密度明显减轻和(或)有蓝变特征或有天牛危害症状的树木、枝条、木材(含原木、锯材)及其制品。

3.3  现场检验

3.3.1  检查木材(含原木、锯材)及其制品的截面是否有松脂痕迹、密度明显减轻、木质部有蓝变现象及有天牛危害的蛀道、蛹室。

3.3.2  检查枝条、伐桩及其制品是否有天牛蛀道、蛹室、补充营养取食痕迹。

3.3.3  对有蓝变、天牛蛀道、蛹室的样本,每个样本取2份样品带回室内做进一步鉴定。取样品时注意选取靠近蛀道、蛹室的部位,所取样品不得带有树皮。

4  检疫检验

4.1  对产地检疫、调运检疫所取的样品(含诱集到的天牛成虫)经制备后,采用贝尔曼漏斗法或浅盘法进行分离、镜检。具体方法见附录1。

4.2  根据以下特征,鉴定是否属伞滑刃属:虫体通常细长,唇区高,缢缩明显。口针有小的基部膨大。排泄孔位置通常在中食道球后方。阴门有时突出,后阴子宫囊长。雌虫尾端钝圆或尖。交合刺大而狭,基部通常有明显的喙。雄虫尾部向腹面弯曲,尾端尖,有一短的尾端交合伞。在尾部通常有2对乳突,1对在肛门前,1对在肛门后。无导刺带(引带)。分属检索表见附录2。

4.3  对照松材线虫形态特征,鉴定是否为松材线虫Bursaphelenchus xylophilus (Steiner et Buhrer) Nickle。松材线虫与近似种拟松材线虫B. mucronatus在形态上的主要区别见附录3。

5  除害处理

5.1  发现携带松材线虫的木材(含原木、锯材)及其制品、枝条、伐桩等,可采取切片处理、热处理、熏蒸处理、销毁处理。

5.2  将病木切成厚度不超过1 cm的碎片后用作纤维板、纸浆等工业原料。或将病死木用旋切机切成厚度为3 mm以下薄片,经80 ℃烘房热烘6 h,制成刨花板、胶合板。

5.3  熏蒸处理方法见附录4。

5.4  将病树去皮锯板后置于热处理房,加热至木材中心温度达到65 ℃以上并保持2 ~ 3 h(或利用微波处理),取出检查松材线虫死亡率,若死亡率达不到100%,继续进行处理直至松材线虫全部死亡为止。

5.5  如不具备上述条件,就地烧毁。

 

附件1

线虫分离方法

分离线虫可采用贝尔曼漏斗法和浅盘法。

贝尔曼漏斗法  将玻璃漏斗(直径为10 ~ 15 cm)置漏斗架上,下面接一段(10 cm左右)橡皮管,橡皮管上装一个止水夹。将劈成“火柴杆”状大小的分离材料,取湿重10 g,用两层纱布包好,放入漏斗中,然后放入清水,清水以浸没分离材料为度。经过4 ~ 24 h,由于趋水性和本身的重量,线虫离开植物组织,并在水中游动,最后沉降到漏斗底部的橡皮管中。打开止水夹,取底部约5 ~ 15 ml的水样,其中含有样本中大部分活动的线虫。在解剖镜下检查,如果线虫的数量少,可以离心(1500 r/min,2 ~ 3 min)沉降后再检查。

浅盘法  浅盘分离装置主要由两只不锈钢浅盘组成,其中口径略小的一只底部为粗网筛,放在另一只浅盘上面。将两层纱布打湿铺于筛盘上,把样品劈碎(或钻取的木屑)置于筛盘纱布上,慢慢注入清水,使水浸没样品。分离结束后,移去筛盘,把大盘内的分离液集中于小烧杯内。小烧杯内的线虫分离液可通过自然沉降或离心机(1500 r/min,2 ~ 3 min)浓缩至适宜的量,以便镜检。

改进型线虫分离器法  改进型线虫分离器分离线虫,兼顾漏斗法和浅盘法各自的优点。分离器由一只网筛、乳胶管、止水夹和一次压模成型的主体构成。在筛网上放两层纱布,再将木屑或劈好的小木条放在上面。从网筛外缘加水至样品水平的位置。在20℃~30 ℃下放置12 h后,打开止水夹,用离心管接取约5mL 分离液;静止自然沉淀30min或1500r/min,离心2min,吸去离心管内上清液,获得浓度较高的线虫悬浮液供镜检。

常规镜检  分别将各标号盛有线虫分离液的培养皿置于解剖镜下观察,先确认有无线虫。对有线虫的样品进行活体镜检,观察它的一般形态结构。然后选择几条成熟、特征易观察的线虫,用针或吸管移至载玻片上的水滴中。将此载玻片在酒精灯火焰上方往返几次(5 ~ 6 s)或放置于已盛满高温热水、打开盖子的保温瓶口上,蒸30 ~ 60 s至虫体死亡,加盖玻片后在显微镜下观察。根据形态特征予以初步鉴别,以确定是否需作进一步的鉴定。

快速镜检  (1)用显微镜直接观察线虫浓缩分离液。分离液经一定时间后,当漏斗下端和乳胶管内出现透明度降低甚至混浊现象、表明线虫的游离量较多时,即可用培养皿接取混浊状分离液3 ~ 5滴,直接置于解剖镜下观察;如有线虫,就将盛有分离液滴的培养皿,放置于已盛满高温热水、打开盖子的保温瓶口上,进行30 ~ 60 s的热杀处理,擦干培养皿底部凝结的小水珠,直接放置于显微镜下(先用低倍物镜,找到目标线虫,再转换到高倍物镜)观察形态特征予以鉴别。(2)用显微镜直接观察线虫分离液。用培养皿盛放贝尔曼漏斗放出的线虫悬液适量,直接移放在光学显微镜下观察,用低倍镜调整焦距,找到线虫,一手移动培养皿,不断变换所观察线虫的位置,一手不断调整焦距。在10倍的接物镜下松材线虫的基本形态鉴定特征如头部、中食道球、阴门、交合刺、尾形等都可以清晰地观察到。发现分离液中存有松材线虫时,挑取线虫并制成临时玻片标本进一步观察。

形态鉴定  依据雌雄成虫的形态,主要是雌成虫的形态进行鉴定。但分离到的线虫没有成虫或极少时,需进行培养,以获得大量雌雄成虫供鉴定。

常见的松材线虫培养方法是利用真菌培养线虫。

100 ml烧瓶中加入约30 g浸泡2 ~ 4 d的玉米粒,棉塞封口;或按5:1的比例将玉米粒与来自健康黑松或马尾松的木屑混合后装入100 ml烧瓶中,棉塞封口。经121 ℃,10.34×10Pa条件下灭菌40 min,冷却后接种灰葡萄孢Botrytis cinerea或球壳孢Sphaeropsis sapinea等线虫喜食真菌,待真菌长好后,接种松材线虫,并置于25 ℃下培养。

松材线虫表面消毒  松材线虫分离纯化后,为了避免受到污染,在培养之前,需对线虫体表进行消毒。消毒方法和消毒液根据工作需要进行选择,一般松材线虫的表面消毒液为0.002 %放线菌酮和0.1 %硫酸链霉素的抗菌素混合液。

(1)供试样品松材线虫个体较多时,在离心管内进行消毒。具体做法是:通过离心浓缩线虫至离心管底部,用无菌滴管将底部线虫液约2 ml移入另一支无菌离心管中。加入2 ml双倍浓度的消毒液,轻轻振荡混匀,处理5 min后,在1500 r/min下离心5 min,吸去上清液。按上述步骤重复消毒1次,用无菌水换洗2次。最后用无菌滴管将线虫吸入真菌培养基上。

(2)供试样品松材线虫个体较少时,在载玻片上进行消毒。具体做法是:将载玻片在70%酒精中浸泡1 min,经过火焰灭菌,冷却后置于双目解剖镜镜台上。将消毒液或无菌水分开滴在载玻片表面的3个点上,每点1滴,其中2个点为消毒液。挑线虫至消毒液中,约1 min后再依次转入另一消毒液滴和无菌水中。最后用无菌细头滴管将经过消毒的线虫转至真菌培养基上。

样木保温保湿培养  将发现幼虫的样品切成长约10 cm,横截面长、宽各1 cm的小木棍多根,使其一端浸在水中至1/3处,放入25 ℃保温保湿培养箱中培养线虫,2 ~ 3 d后能够获得所需的成虫。同样将样本适量喷水后,外套牛皮纸并扎紧,放入培养箱中3 ~ 5 d后也能获得松材线虫成虫。

 

松材线虫临时玻片标本的制作

在载玻片上滴一滴水,用挑针或吸管将线虫移入水滴中。或用吸管吸一滴线虫悬液在载玻片上。然后在酒精灯上将线虫杀死。用解剖镜检查线虫是否死亡,并用挑针将线虫轻轻按到水滴底部,以免盖盖玻片时线虫会随水流到盖玻片边缘,影响观察。在盖盖玻片时要从侧面慢慢放下,尽量不产生气泡。如果有条件的话,最好在制片前在载玻片上用指甲油画一小的圆圈,画得很薄。一方面它可起支撑作用,避免盖玻片压迫线虫虫体,另外也可阻止线虫随水流到盖玻片边缘。如果线虫已经杀死并固定,就可直接用固定液做浮载剂制片。制片后立即观察,可不用封片。如果观察时间较长,可用封片剂将盖玻片边缘封固。蜡、指甲油、中性树胶、阿拉伯树胶等均可用来封片。

这种玻片制作简单,不需要特殊的仪器。而且线虫未经透明,各种器官均非常清晰,易于辨认。

 

附件2

滑刃目线虫分属检索表1.侧区通常至少有6条侧线,神经环环绕食道腺;雄虫交合刺较细,有明显的基柄,似垫刃类交合刺,引带显着、细长……………………………………………………………………2

侧区侧线不超过4条,神经环环绕肠前端;雄虫交合刺粗,玫瑰刺形或不规则形,通常无引带或引带短、不明显…………………………………………………………………………3

2.食道腺叶状从背面长覆盖肠;雌虫尾圆筒形或近圆筒形,端宽圆;雄虫交合伞显着,伸对尾端………………………………………………………………………真滑刃属 Aphelenchus

食道腺长瓶形或梨形,不覆盖肠;雌虫尾圆锥形,端圆并且有1个尾尖突;雄虫无交合伞……………………………………………………………………拟滑刃属 Paraphelenchus

3.雌虫有阴门盖;雄虫尾端包有交合伞…………………………………………………………4

雌虫通常无阴门盖,若有则尾端有4个端缘呈穗状的梗节;雄虫无交合伞…………………………………………………………………………………………………5

4.虫体细(a值约为100);雌虫尾呈长圆筒形、端圆…………细杆滑刃属Rhadinaphelenchus

虫体粗(a值小于60);雌虫尾短,呈圆筒形到圆锥形,端圆到锐尖,有时有1个尾尖突……………………………………………………………………伞滑刃属 Bursaphelenchus

5.雌雄虫尾端有4个端缘呈穗状的梗节,雌虫有和无阴门盖……咽滑刃属Laimaphelenchus

雌雄虫尾端出上述特征,雌虫无阴门盖………………………………………………………6

6.头部高,显着缢缩成球状,前端呈盘状;口针长35μm,无基部球………猪头属 Anomyctus

头部低,微缢缩到显着缢缩,但不呈球形,前端也不呈盘状;口针短于20μm……………7

7.角质层环粗(宽1.7μm),头部显着缢缩;口针粗,长约17μm,基部球大、圆;食道前体部的前部宽,后部呈细柱形,整个前体部呈倒瓶形………………………大针属 Megadorus

角质层环细,头部微缢缩;口针细,长度通常为10-12μm(一般不超过20μm),有小的基部球或基部膨大;食道前体部柱形……………………………………滑刃属Aphelenchoides

 

附件3

松材线虫与近似种拟松材线虫B. mucronatus在形态上的主要区别

    拟松材线虫雌虫尾部和幼虫尾部都呈圆锥形,尾端指状,有明显的尾尖突。雌成虫尾尖突长度为3.18 ~ 5.72μm,幼虫为2.54 ~ 3.81μm。松材线虫雌虫亚圆锥状,尾端宽圆,无尾尖突或尾端指状,如有尾尖突,幼虫为0.63 ~ 1.25μm,成虫为0.63 ~ 1.88μm(图1-4)。拟松材线虫交合伞平截形,交合伞末端边缘有2个小的突起,松材线虫交合伞卵圆形。

图1-2  松材线虫形态特征

A 雌成虫    B雄成虫  C 雄虫尾端   D 交合伞    E 交合刺   F雌虫前部(口针、中部食道球神经环、肠道)

G雌虫阴门  H ~ J 雌虫尾端变化

图1-3  拟松材线虫形态特征

1.雌成虫   2.雄成虫   3.雌虫前部   4、5 雌虫尾部   F.雄虫尾端   7.交合伞

8.三龄幼虫尾节   9.四龄耐久型幼虫尾部   10.四龄耐久型幼虫前端

图1-4  松材线虫和拟松材线虫雌成虫的尾端形状

附件4

熏蒸处理

目前应用的熏蒸剂有溴甲烷(含量不低于98%)、硫酰氟(含量不低于95%)和磷化铝(含量不低于56%)。

熏蒸用具

熏蒸帐幕材料:厚度0.15 mm以上的聚乙烯帐幕或厚度0.19 mm以上的聚氯乙烯帐幕或双面挂胶苫布。

施药管(溴甲烷和硫酰氟):采用不易腐蚀的高压氧气管。

盛药盘或盛药罐(磷化铝)。

磅秤:称量范围0 ~ 150 kg,感量0.1 kg。

测温装置:水银温度计(测温范围0 ~ 100 ℃,精度0.5 ℃)或数字测温计(测温范围-10 ~ 100 ℃,精度0.1 ℃)或远红外测温计(测温范围-20 ~ 300 ℃,精度0.1 ℃)。

浓度检测器材:溴甲烷、硫酰氟气体浓度检测采用热导式熏蒸气体浓度检测仪,灵敏度1g/m3。磷化氢气体浓度检测管,1 ~ 50 ml/ m3和100 ~ 2 000 ml/ m3;溴甲烷气体浓度检测管,5 ~ 50 ml/ m3和10 ~ 100 g/ m3。上述检测设备也可用于渗漏检测。

防漏检测仪器:使用卤化物渗透检测器、测溴灯等各种类型的检测器进行检漏。使用卤化物渗漏检测器时先用火柴从燃烧的开口处将其点燃,然后再向左慢慢转动调节阀,待反应板或锥形体发热变红时,把火焰调至能够维持这种颜色的最小范围。将探测管末端开口处放在被检处,然后观察火焰的颜色是否发生变化,如火焰颜色变绿,则说明有溴甲烷外漏,外漏程度越严重,火焰的绿色越深,以致变为蓝绿色、蓝色。

溴甲烷帐幕熏蒸方法

熏蒸场地:就地选择一块地势平坦、土壤紧密、阳光较充足、通风良好、交通方便、远离居民区的地块作为熏蒸场地。

熏蒸布置:将须熏蒸处理的松木或其加工制品等在选择好的熏蒸场地上堆垛。成一个长立方形。一般垛高为1.5 ~ 2.0 m。

挖沟:在堆垛四周挖一圈宽20 cm以上,深30 cm以上的沟,挖出的土堆放在沟外侧,用作覆盖帐幕后回填。

覆盖帐幕:将准备好的帐幕覆盖在堆垛上,帐幕四周边埋在沟内,用沟外侧的土回填,适当加水,踩紧踏实。

投药量和熏蒸时间:投药量和熏蒸时间的选择参照下表,其中温度为熏蒸当日最高气温;投药量指帐幕内容积每立方米的投药量。当日最高气温低于4 ℃时则停止熏蒸。

在熏蒸密闭空间内的温度低于15 ℃或投药量大于3 kg时,溴甲烷熏蒸应采用药剂汽化装置投药,汽化器出口气体温度不低于20 ℃。

表1-1 投药量和熏蒸时间

 

温度(℃)

投药量(g/m3

熏蒸时间(h)

4 ~ 10

104 ~ 125

48

 

69 ~ 83

72

10 ~ 20

63 ~ 83

48

 

42 ~ 56

72

20以上

42 ~ 63

48

 

28 ~ 42

72

 

投药:投药前先检查帐幕有否破损,确认封闭严密后开始投药。操作人员站在上风处,缓缓打开置于磅秤上的钢瓶阀门,使溴甲烷通过投药管进入堆垛,直至磅秤上显示已放完所需的总投药量时即关闭阀门,取出投药管,封好进药口,保持密闭至所选择的熏蒸时间。

散毒:熏蒸完毕,先将帐幕下风方向一边打开,0.5 h后再揭幕充分散毒。

效果检查:效果检查需在揭幕1 h后进行。在堆垛上部抽取3段长约50 cm的样段,将3个样段分别劈开检查松褐天牛幼虫死活。松褐天牛的死活可参照表1-2鉴定。

 

    表1-2 松褐天牛存活与死亡特征

 

检查项目

体表色泽

有光泽

无光泽

虫体软硬程度

有弹性

无弹性

对外界刺激反应

不  动

头部位置

向腹面弯曲

前  伸

虫体截面形状

圆  形

扁圆形

 

 

另外,在使用硫酰氟熏蒸时,常用量为30 g/m3,温度17 ~ 30 ℃,密闭48 h,松褐天牛成虫和幼虫死亡率100 %。溴甲烷和硫酰氟在熏蒸时加入适量CO2,有显着增效作用,加入量为熏蒸剂的10% ~ 40 %。

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